IHC 抗原修復方法介紹 (IHC Antigen Retrieval)
IHC實驗抗原修復的兩種方法：加熱法（也稱為熱誘導表位修復或 HIER）和酵素法。
- 大多數福馬林固定的組織在免疫組織化學染色之前需要抗原修復步驟。固定過程中形成的亞甲基橋交聯蛋白質並掩蓋抗原位點。抗原修復方法會破壞這些亞甲基橋並暴露抗原位點，使抗體能夠結合。抗原修復的兩種方法是熱誘導抗原表位修復 (HIER) 和酵素修復。
- 酵素修復有時會破壞切片的形態，因此需要測試濃度和處理時間。
- 熱誘導表位修復最常使用高壓鍋、微波爐或蒸籠進行。一些實驗室使用設定為 60°C 的水浴，並將玻片在修復溶液中孵育過夜。當處理在較高溫度下加熱時從載玻片上脫落的組織切片時，這非常有用；特別是骨骼、軟骨和皮膚。
- 除非抗體數據表上註明了抗原修復方法，否則必須透過實驗找到每種抗原的最佳方法。這也適用於熱介導修復所用緩衝液的選擇。我們建議測試多種方法以找到提供最佳染色的檢索方法。
方便的緩衝液可帶來可靠的結果
為了獲得熱介導抗原修復的穩健結果，我們建議使用我們預先配製的抗原修復緩衝液。其中包括三種最常用的緩衝液 – 從我們的檸檬酸鹽緩衝液試劑盒、Tris-EDTA 緩衝液試劑盒或EDTA 緩衝液試劑盒中進行選擇；或使用我們的Tris 緩衝液試劑盒或Tris-HCl 緩衝液試劑盒。
我們還提供通用熱介導抗原修復試劑盒（與我們領先的 PD-L1 克隆 28-8 一起使用），該試劑盒與大多數抗體相容，並且無需使用多種緩衝液。
對於酵素抗原修復，我們推薦我們的胰蛋白酶溶液試劑盒。我們也提供胃蛋白酶溶液套件和蛋白酶 K 溶液套件。或者，您可以準備自己的緩衝液和解決方案，並使用下面相同的建議方法。
用於熱誘導表位修復的緩衝液
#以下解決方案是 HIER 中三種較流行的緩衝液。在沒有資料表資訊的情況下，最好透過試驗來選擇檢索緩衝液。
檸檬酸鈉緩衝液（10 mM 檸檬酸鈉，0.05% Tween 20，pH 6.0）
- 檸檬酸三鈉（二水合物）2.94 g
- 蒸餾水 1 公升
- 混合溶解。用 1N HCl 將 pH 調至 6.0。
- 加入 0.5 mL Tween 20 並充分混合。室溫保存3個月或
- 4°C 可延長儲存時間
1 mM EDTA，pH 8.0
- 乙二胺四乙酸 0.37 克
- 蒸餾水 1 公升
- 用 NaOH 調 pH 至 8.0
- 室溫保存3個月
Tris-EDTA 緩衝液（10 mM Tris 鹼、1 mM EDTA 溶液、0.05% Tween 20、pH 9.0）
- 三羥甲基氨基甲烷 1.21 克
- 乙二胺四乙酸 0.37 克
- 蒸餾水 1 公升
- 混合溶解。將 pH 值調整至 9.0。
- 加入 0.5 mL Tween 20 並充分混合。室溫下可保存 3 個月，4°C 下可保存更久。
熱誘導表位修復方法：高壓鍋
在此過程中，載玻片應放置在金屬架中。
材料與試劑
- 家用不銹鋼壓力鍋
- 熱板
- 載玻片架的容器，可容納約 400–500 mL
- 抗原修復緩衝液（Tris/EDTA pH 9.0、檸檬酸鈉 pH 6.0 或其他）
方法
建議進行對照實驗來優化檢索時間，即在免疫組織化學染色之前檢索同一組織切片的玻片 1、2、3、4 和 5 分鐘。
- 將適當的抗原修復緩衝液添加到高壓鍋中。將高壓鍋放在電爐上並打開全功率。此時不要蓋上高壓鍋的蓋子，只需將其放在上面即可。在等待高壓鍋沸騰的同時，將切片進行脫蠟和再水化。
- 煮沸後，將玻片從自來水轉移到高壓鍋中。使用熱溶液時要小心－使用鑷子。
- 按照製造商的說明蓋上高壓鍋蓋。
- 一旦炊具達到全壓，時間 3 分鐘。
- 3 分鐘後，關閉電爐並將壓力鍋放入空水槽中。
- 啟動壓力釋放閥並用冷水流過炊具。減壓後，打開蓋子，將冷水倒入炊具中，煮10分鐘。這是為了讓載玻片充分冷卻以便可以對其進行處理，並允許抗原位點在暴露於高溫後重新形成。小心處理熱溶液。
- 繼續免疫組織化學染色方案。
熱誘導表位修復方法：微波
不建議使用家用微波爐。熱點和冷點很常見，導致抗原修復不均勻。由於缺乏加壓環境，抗原修復時間通常較長，幾乎總是導致切片解離。科學的微波爐較為合適。大多數品牌都有機載壓力容器，可以將溫度保持在 98°C 恆定，以避免切片解離。
使用此方法時，緩衝液可能會溢出，大量檢索緩衝液會蒸發。請務必注意載玻片容器的緩衝液水平，並在必要時添加更多緩衝液。不要讓載玻片變乾。
在此過程中，載玻片應放置在塑膠架和容器中。標準玻璃組織染色架和器皿在加熱時會破裂。
材料與試劑
- 科學微波爐或家用（850 W）
- 附載玻片架的微波容器，可容納約 400–500 mL 或 Coplins 罐
- 抗原修復緩衝液（例如 Tris/EDTA pH 9.0、檸檬酸鈉 pH 6.0 等）
方法
- 將切片進行脫蠟和再水化。使用足夠體積的抗原修復溶液覆蓋玻片至少幾公分。
- 將適當的抗原修復緩衝液添加到微波容器中。使用非密封容器，以便在煮沸過程中蒸發。確保在操作過程中監測蒸發情況並注意沸騰，並且不要讓載玻片變乾。
- 將載玻片放入微波爐容器中。將容器放入微波爐。如果使用家用微波爐，請設定全功率並等待溶液沸騰。從此時開始煮 20 分鐘。如果使用科學微波爐，請進行編程，以便在溫度達到 98°C 後 20 分鐘恢復抗原。使用非密封容器，以便在煮沸過程中蒸發。確保在操作過程中監測蒸發情況並注意沸騰，並且不要讓載玻片變乾。
- 20 分鐘後，取出容器並向其中註入冷自來水 10 分鐘。使用熱溶液時要小心。這使得載玻片能夠充分冷卻，以便可以對其進行處理，並允許抗原位點在暴露於高溫後重新形成。
- 繼續免疫組織化學染色方案。
熱誘導表位修復方法：蒸籠
許多實驗室使用蒸籠或電鍋進行熱介導抗原修復。該過程與微波類似，它將緩衝液的溫度保持在 100°C，但沒有微波方法的劇烈沸騰。此方法可適用於設定為 100°C 的水浴槽來代替蒸籠。
在此過程中，載玻片應放置在塑膠或金屬架和容器中。標準玻璃組織染色架和器皿在加熱時會破裂。
材料與試劑
- 蔬菜蒸籠
- 帶有載玻片架的容器，可容納約 400–500 mL（如果使用 Tissue-Tek 容器，則為 250 mL）
- 抗原修復緩衝液（例如 Tris/EDTA pH 9.0、檸檬酸鈉 pH 6.0）
方法
- 如上所述對切片進行脫蠟和再水化。
- 根據製造商的說明設定蔬菜蒸籠並預熱。使用非密封容器，以便在煮沸過程中蒸發。確保在操作過程中監測蒸發情況並注意沸騰，並且不要讓載玻片變乾。
- 將燒瓶中適當的抗原修復緩衝液預熱至沸騰。
- 將裝有載玻片架的容器放入蒸籠中。
- 小心地將熱緩衝液加入容器中，然後添加載玻片架。如果更方便，請在將容器放入蒸籠之前將緩衝液添加到容器中。
- 蓋上蒸籠的蓋子。緩衝液的容器也應該有蓋子。載玻片架最初會降低抗原修復溶液的溫度，但會在幾分鐘內恢復到 95–100°C。
- 從此時開始將容器放入蒸籠 20 分鐘。
- 20 分鐘後，取出容器並向其中註入冷自來水 10 分鐘。使用熱溶液時要小心。使用非密封容器，以便在煮沸過程中蒸發。確保在操作過程中監測蒸發情況並注意沸騰，並且不要讓載玻片變乾。
- 繼續免疫組織化學染色方案。
酵素法抗原修復
使用的酵素將在抗體數據表上註明。如果沒有，胰蛋白酶可用於需要福馬林/PFA 固定後修復的多種抗原。
將酵素溶液施加到組織上至少有兩種方法：直接將溶液移至玻片上的組織上，或將組織載玻片架放入酵素溶液容器中。第一種方法使用較少的試劑，但由於每張玻片都需要單獨處理，因此需要仔細監控每張玻片的孵育時間，以確保所有玻片都接受相同的處理。因此，將大批量載玻片浸入酵素溶液容器中更容易處理。如果使用自動染色系統（例如 Ventana），請諮詢製造商以取得適當的酵素修復方案。
移液方法：材料與試劑
- 37°C培養箱
- 加濕室（培養箱本身或有濕紙巾的容器）
- 兩個有載玻片架的 TBS 載玻片架容器
- 酵素抗原修復溶液（胰蛋白酶，見下文）
胰蛋白酶儲備液（0.5% 蒸餾水）
- 胰蛋白酶 50 毫克
- 蒸餾水 10 毫升
- 混合溶解，-20℃保存
氯化鈣儲備液（1%）
- 氯化鈣 0.1 克
- 蒸餾水 10 毫升
- 充分混合並儲存於 4°C
胰蛋白酶工作液（0.05%）
- 胰蛋白酶儲備液 (0.5%) 1 mL
- 氯化鈣儲備液 1% 1 mL
- 蒸餾水 8 毫升
- 用 1N NaOH 將 pH 調至 7.8。 4℃保存1個月，-20℃長期保存
移液方法: 方法
- 準備胰蛋白酶溶液並預熱至 37°C。小心地吸乾組織切片周圍多餘的水，並將酵素溶液（通常 50-100 μL 就足夠了）移至切片上。可能需要用移液管吸頭將溶液塗抹在切片周圍；小心不要損壞組織。
- 將載玻片放入加濕的容器中，然後放入 37°C 培養箱中。避免將玻片直接放在培養箱架上，因為溫度變化可能會影響染色強度。理想情況下，裝有載玻片的容器在培養箱中預熱。
- 10-20 分鐘後（這需要優化），從培養箱中取出玻片並轉移到盛有自來水的容器中的架子上。用自來水沖洗 3 分鐘。
- 繼續免疫組織化學染色方案。
浸泡法：材料和試劑
- 37℃水浴
- 載玻片架和載玻片架容器
- 酵素法抗原修復液（胰蛋白酶參見酵素法修復移液法）
浸泡方法: 方法
請務必閱讀您選擇的酵素的製造商文獻，因為某些酵素需要特定的緩衝液和輔助因子才能發揮活性。
- 將水浴設定為您所使用的酵素的最佳溫度。將超純水加入兩個可以容納玻片架的容器中。將容器放入水浴中加熱。使用足夠量的水或緩衝液覆蓋玻片。
- 如上所述對切片進行脫蠟和再水化。將載玻片放入一個水容器中加熱。將冷載玻片放入酵素溶液中會降低溶液溫度，降低酵素活性並導致抗原位點修復不足。
- 用另一個容器中的溫水製備酵素抗原修復緩衝液，然後將容器放回水浴中，使溶液重新加熱。盡快製備酵素抗原修復溶液，以避免損害酵素的活性。在放入載玻片之前讓此溶液恢復到溫度。
- 將加熱的玻片轉移到酵素溶液中 10-20 分鐘，間歇性輕輕攪拌，然後取出玻片並將其放入流動的自來水中 3 分鐘以沖洗掉酵素。在免疫組織化學染色前，應將組織切片在酵素溶液中孵育 10、15、20、25 和 30 分鐘來優化回收時間。
- 繼續免疫組織化學染色方案。
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