基因剔除Knockout(KO)驗證–確認抗體特異性
為確保抗體擁有高度特異性，透過CRISPR-Cas9基因組編輯技術使用 KO 驗證，以證實可靠的研究結果。
困難與解決方案
抗體是生命科學和臨床研究中最常使用的工具之一，用於研究蛋白質在各種生物途徑和疾病中的功能。
一個好的抗體可以表現出目標蛋白的”特異性”和”敏感性”，即使在低表達的狀態也能辨識目標蛋白。然而越來越多的研究顯示，並非所有抗體都具有如此特異性，許多抗體會與脫靶蛋白交叉反應。此反應會導致實驗不可再現的問題，而這些非特異性抗體會造成浪費資源並損害科學的進展。
剔除(KO)驗證是一種可靠的技術，用基因剔除技術使細胞株和組織不表達目標蛋白，接著進一步測試目標抗體來確認抗體特異性。當在 KO細胞株中測試時，特異性抗體不應產生訊號，而在未剔除型 (WT) 細胞株中會產生特異性目標蛋白訊號。通過此方式，KO驗證可作為真正的陰性對照來確認抗體對目標的蛋白的特異性。
Abcam使用CRISPR-Cas9建立多樣的人類KO單倍體細胞庫，每株細胞也都經過Sanger 定序驗證KO，最後執行抗體驗證。KO細胞株提供來自單個等位基因KO的功能完全喪失表現型，並消除二倍體細胞模型中第二個等位基因敲除的任何掩蔽。
剔除驗證測試結果
在對的抗體進行 KO 驗證時，Abcam主要使用western blot來評估結果。以下範例為每種狀況Abcam如何處理。
特異性抗體
結果：預期蛋白分子量(MW)的band在 KO 樣品中消失。
後續：通過KO驗證，保證抗體的特異性。
部分特異性抗體–出現額外的band
結果：預期蛋白的MW在KO樣品中消失，但額外的band出現在不同的MW處。
後續：將進行額外的研究和測試以確定額外的band。
非特異性抗體-KO樣品有微弱訊號
結果：與WT相比，預期MW的band仍然以較低強度存在於 KO 中。
後續步驟：將進行額外的研究和測試以確定 KO 樣本中訊號背後的原因。
非特異性抗體-KO樣品有訊號
結果：在KO樣品預期的MW仍然與WT有相同強度的訊號。
後續：從目錄中刪除該抗體，並推薦具有特異性的抗體作為替代。
非特異性抗體-KO和WT樣品中均無訊號
結果：抗體無法辨識WT和KO樣本中的目標band。
後續：從目錄中刪除該抗體，並推薦具有特異性的抗體作為替代。
經剔除驗證的抗體：
當看到KO驗證標籤時，您可以相信該抗體不僅已在推薦的應用和物種中得到驗證，且其特異性已通過Abcam內部KO 驗證方法得到確認。
剔除細胞株推薦：
CRISPR-Cas9 技術的應用使Abcam能夠開發範圍廣泛的KO細胞株，進而提供可靠的抗體，為您節省時間和金錢。每個KO細胞株都經過單獨克隆挑選，通過Sanger定序驗證。
