Generating cell knock-outs with CRISPR-Cas9 technology
使用CRISPR-Cas9 技術開發基因剔除細胞
人類全基因的確立使研究員能探討許多特殊或遺傳疾病的特異性基因突變，若能夠修改特定基因便能研究其功能，例如在正常生理下缺乏特定蛋白，生化途徑的改變或功能障礙可以深入了解蛋白發揮的作用。此外以高精準剔除特定基因技術有助於建立基因相關疾病的模型，有助於開發新的治療方法和新的基因療法。
基因序列的修飾最初是使用DNA 切割技術，如Zinc-finger nucleases (ZFN) 和 TAL effector nucleases (TALEN)，然而這些技術複雜且耗時。隨後發現的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術使基因編輯的特異性大大提高，此技術進一步擴展操控DNA 的潛力。
CRISPR-Cas9簡介
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 基因片段是組成細菌免疫系統的 DNA， 它能保護細菌免受入侵病毒的侵害。這些序列引導核酸酶切割侵入細胞的相同序列的DNA，最終使病毒被破壞。
CRISPR-Cas9的DNA切割是由 Cas9 執行，其具有切割 DNA 的能力，此外搭配由CRISPR轉錄單鏈 RNA 序列做為嚮導，使酶能夠在特定的位置破壞病毒基因。上述組成CRISPR/Cas9系統的分子也可以運用在真核細胞中。使用合成guide RNA (gRNA)、Cas9 酶便能針對目標基因，在目標序列末端切割 DNA 三個鹼基。
CRISPR/Cas9 系統提供強大的方法來替換、刪除或插入特定基因序列。 Cas9 的切割位也有特定的規則以及周圍的核甘酸決定，因此我們可以可靠、精確地預測CRISPR-Cas9 DNA 修飾。
綜合上述，CRISPR/Cas9技術可以切除整個基因以研究其功能，亦或是複製已知會導致人類患者疾病的點突變，插入突變以提供特定疾病模型作為研究。
使用 CRISPR-Cas9 建立基因剔除細胞株
CRISPR/Cas9 打破先前的限制，大幅提升基因編輯的準確性和特異。CRISPR/Cas9的效率是傳統 ZFN和TALEN 系統的三至四倍。 此外只需加入幾種不同的guide RNA，即可刪除多個基因。
目前此技術已被廣泛用於建立剔除細胞株，可以精準的去除目標基因，進而完全消除其轉譯的蛋白質。後續能夠研究基因功能和基因間的相互作用，並能促進深入研究人類的遺傳疾病。
使用 CRISPR/Cas9 基因剔除的注意事項
在使用CRISPR/Cas9技術時，需考慮各種因素以優化其精準度和成功率在各種基因編輯方法都會考慮到脫靶(off-target)的問題，當核酸酶在預定位置以外切割 DNA 時，就會出現脫靶效應。這種預期之外的 DNA 斷裂可能會產生與目標基因無關的額外影響。 因此可以使用single nucleotide polymorphism(SNP)或螢光標記來驗證剔除的準確性。不過也需謹慎的驗證，避免將自然多樣性誤解為脫靶突變。
當基因剔除後，會驗證基因是否真的已被刪除，表現型可以做為是否成功的初始指標，此外分子技術通常也可用於確認編輯的結果。 作為第一步，DNA mismatch detection assays可以驗證基因是否剔除。接著最終最嚴謹的方式是單克隆細胞株的全基因定序，確認所有的等位基因的剔除以及沒有其他的基因被刪除 .
Abcam基因剔除細胞
CRISPR 基因剔除提供很好的機會來測試基因功能、相互作用和開發疾病模型以研究潛在的治療方法，然而開發基因剔除需要專業知識且非常耗時。
為了使研究人員不受到專業知識且時間上的限制，abcam能提供各種基因剔除的細胞株和細胞裂解物，可快速獲得並適用於各種研究應用。 Abcam 擁有業界最大的二倍體基因剔除細胞株庫，包括 Hela、HEK293T、A549、HCT116、Hep G2 和 MCF等。
每個剔除細胞株和裂解物都是使用標準化的 CRISPR-Cas9 方法所生成，並與野生型裂解物比較，以便評估剔除的影響。 單克隆細胞株均通過 Sanger 定序和WB驗證，以確保編輯的準確性。
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